Микотоксины являются токсичным продуктом метаболизма микроскопических плесневых грибов, оказывающие специфическое патологическое действие на организм человека, животных и растений. Подобно микроорганизмам, генерирующим антибиотики, плесневые грибы, вырабатывающие микотоксины, распространились по всему миру. Афлотоксины - самая токсичная разновидность микотоксинов. Некоторые продукты подвержены особому риску заражения афлотоксинами, обусловленному подходящими условиями для роста определенных видов грибов: сухофрукты, специи, орехи (арахис, фундук, фисташки) и зерновые (пшеница, кукуруза).

Для образования микотоксинов требуются определенные температурные условия, повышенная влажность и источник питательных веществ от пораженных грибком продуктов. Такие условия часто возникают при длительном хранении пищевых продуктов без соблюдения необходимых норм. Поскольку микотоксины устойчивы к воздействию повышенных температур, они, как правило, остаются даже после термообработки пищи.

Поскольку содержание микотоксинов влияет на качество и пищевую ценность кормового сырья и продуктов, контроль их содержания регламентируется целым рядом нормативных документов. В частности, существуют государственные стандарты определения иммуноферментным методом содержания Т-2 токсина, зеараленона (Ф-2), охратоксина А в фуражном зерне и продуктах его переработки, афлатоксина В1, роридина А, охратоксина А, стеригматоцистина, Т-2 токсина, зеараленона, фумонизина В1 в кормах.

Однако основным методом определения микотоксинов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – метод, обладающий такими преимуществами, как высокая селективность, воспроизводимость и низкие пределы обнаружения. Большинство существующих нормативно-технических документов по определению содержания микотоксинов основано именно на этом методе.

Несмотря на то, что методы ВЭЖХ для определения микотоксинов уже широко распространены и валидированы при анализе различных объектов, до сих пор актуальны исследования по разработке новых методик. Предметом научного интереса является увеличение производительности анализа за счет уменьшения времени единичного определения и увеличение чувствительности анализа.

Определение микотоксинов методом ВЭЖХ, как правило, включает в себя стадию дериватизации определяемых компонентов. Дериватизация может быть как постколоночной, так и предколоночной, а в качестве дериватизирующих агентов используют о-фталевый дикарбоксальдегид, 9-(Флуоренилметил)хлорформиат, растворы галогенов. Однако некоторые токсины имеют природную флуоресценцию, в том числе и афлатоксины, поэтому имеется возможность их прямого определения без процедуры дериватизации. Это значительно упрощает процедуру анализа, сокращает время и стоимость единичного определения.

Определение афлатаксинов без дериватизации требует применения высокочувствительных флуориметрических детекторов. Было опубликовано исследование, в котором возможность такого детектирования доказана экспериментально. При этом результаты анализа сопоставимы с результатами, полученными по методикам, предусматривающим стадию дериватизации.

Был разработан высокочувствительного метода определения афлатоксинов с применением обращено-фазовой аналитической колонки Shodex Silica C18M 4E.

Пробоподготовка
Измельчение
Для достаточного экстракционного извлечения микотоксинов, исследуемый образец должен быть измельчен и гомогенизирован. Поскольку предельно допустимые концентрации микотоксинов варьируются в пределах от 0,025 мкг/кг до 15 мкг/г, а грибковые поражения возникают очагами (гнездами), то отобранная от общего объема анализируемого продукта представительная проба должна быть достаточно большой. Первая стадия измельчения заключалась в размоле представительного количества образца орехов (1-2 кг пробы на тонну орехов) до частиц размером 1-3 мм с помощью дисковой вибрационной мельницы HK20. Такая мельница подходит для быстрого и мягкого измельчения сухих материалов.

Для обработки орехов рекомендуется использование распорных втулок, специально разработанных для измельчения температурно-чувствительных крошащихся материалов. Поскольку микотоксины липофильны, процесс измельчения должен быть максимально мягким для того, чтобы избежать потери жировой фракции из образцов. Достигнутая тонкость 300 мкм является достаточной для последующей экстракции микотоксинов.

Экстракция
Перед экстракцией 25 г гомогенизированного образца помещали в 200 мл раствора воды и ацетонитрила (16:84 объемных %) и встряхивали в течение 60 минут с последующей фильтрацией. 100 мл фильтрата экстрагировали петролейным эфиром, после чего фазу эфира удаляли. Аликвоту оставшейся части перемешивали с адсорбентом активированный уголь/Al2O3/цеолит (7:5:3) в течение 10 минут и затем центрифугировали. Надосадочную жидкость испаряли и повторно растворяли в воде.

После этого раствор пропускали через иммуноафинную колонку для очистки и концентрирования, промывали водой и элюировали метанолом. На иммуноаффиной колонке афлотоксины удерживаются на селективно связывающих антителах и отделяются от матрицы. Элюат анализировали методом ВЭЖХ.

ВЭЖХ анализ ВЭЖХ анализ проводили на жидкостном хроматографе Prominence с флуориметрическим детектором RF-20A (рис. 3), длина волны возбуждения составляла 365 нм, испускания – 450 нм. В качестве подвижной фазы использовали раствор ацетонитрил: вода (40/60) со скоростью потока 0,8 мл/мин. Температура термостата конок составляла 40 °С, объем вводимого образца – 20 мкл. Условия анализа приведены в таблице 1. Полученная хроматограмма представлена на рисунке 1.

Разделение компонентов пробы проводили с помощью обращено-фазовой колонки Silica C18M 4E. Для увеличения чувствительности анализа использовали постколоночную дериватизацию бромными и йодными растворами.

Таблица 1. Условия хроматографического анализа

1 – дериватизированный афлатоксин G1, 2 – дериватизированный афлатоксин B1, 3 –афлатоксин G2, 4 – афлатоксин B2
Рисунок 1. Типовая хроматограмма образца, содержащего микотоксины. Позволяет идентифицировать тип афлатоксина и точно определить его концентрацию.

Предложен метод высокочувствительного определения афлатоксинов с помощью аналитической колонки Shodex Silica C18M 4E.
Часто отгрузка целых партий орехов и подобных продуктов не может быть осуществлена без точного определения содержания афлотоксина. Предложенный метод позволяет получать представительные и оперативные результаты, что является оптимальным решением для контроля качества продукции.